Monitoraggio SARS-CoV-2 in acque reflue urbane - Studio pilota

Tra le persone infettate dal virus, solo quelle sintomatiche si rivolgono di norma al sistema sanitario per sottoporsi a test e vengono pertanto notificate, mentre molte persone con sintomatologia lieve o assente sfuggono al sistema di tracciamento. Tutti però fanno uso dei servizi igienici, e quindi qualsiasi emissione di virus finisce nelle acque reflue e attraverso il sistema fognario viene conferito ai depuratori. Analizzare le acque in ingresso ai depuratori significa poter monitorare la circolazione del virus.

Il prelievo dei campioni

Il prelievo dei campioni avviene 2 volte a settimana: lunedì (raccolta delle 24 ore da domenica mattina a lunedì mattina) e giovedì (raccolta delle 24 ore da mercoledì mattina a giovedì mattina). Il campione viene formato raccogliendo quantitativi di refluo nel corso delle 24 ore in maniera proporzionale all’afflusso orario; in questa maniera il campione è rappresentativo di tutto il bacino d’utenza dei singoli depuratori.

L’Ufficio Tutela acque ha individuato 9 depuratori rappresentativi del territorio, che tenessero conto anche delle caratteristiche geografiche e dell’influenza delle attività turistiche.

I depuratori scelti:

• Bolzano

• Pontives

• Termeno

• Merano

• Media Val Venosta

• Bressanone

• Tobl

• Wipptal

• Wasserfeld.

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Nelle acque reflue sono presenti quantità molto elevate di cellule di batteri e di virus, che popolano il tratto intestinale umano e che vengono espulsi con le feci. Per poter effettuare le analisi è necessario concentrare il campione in laboratorio per estrarre tutto il materiale genetico in esso presente. Il volume iniziale del campione prelevato è di 50 ml, che corrisponde ad una grande provetta, da cui si ottiene il materiale genetico concentrato in 0,1 ml (una goccia). In questa miscela di DNA ed RNA molto eterogenei di provenienza batterica, virale, umana si cercano alcune sequenze geniche dell’RNA⁽¹⁾ relative a proteine specifiche del Coronavirus SARS-CoV-2 attraverso la tecnica della real-time RT-PCR⁽²⁾. L’intensità del segnale è in correlazione con la concentrazione dell’RNA, e quindi del virus in circolazione tra la popolazione.

Nota 1: L’RNA è il materiale genetico del SARS CoV-2, che contiene tutte le informazioni per la moltiplicazione del virus nelle cellule del suo ospite.

Nota 2: La real-time RT-PCR è una tecnica che consente di sintetizzare una molecola di DNA a doppio filamento  a partire da uno stampo a RNA (trascrizione inversa, RT). Successivamente il DNA è amplificato da reazioni a catena di un enzima chiamato DNA-polimerasi. Dopo ogni ciclo di amplificazione, la quantità DNA raddoppia, diventando “visibile” allo strumento e quantificabile in tempo reale durante la reazione. Il corredo genetico del SARS- CoV-2 è un filamento di RNA, per questo motivo è necessario il passaggio di retrotrascrizione.

• Trasporto dei campioni dal punto di prelievo al laboratorio, in condizioni di temperatura refrigerata.

• Aggiunta ai campioni di un virus di controllo per verificare l’efficienza di recupero del materiale genetico dal campione.

• Concentrazione del campione da 50 ml a 0,1 ml.

• Estrazione del materiale genetico (RNA).⁽¹⁾

• Amplificazione (moltiplicazione) in real-time RT-PCR⁽²⁾ dei geni per le proteine E (Envelope), RdRP (RNA polimerasi RNA-dipendente) e N (Nucleocapside). Gli ultimi due geni sono specifici di SARS-CoV-2, il gene E è comune a tutti i Coronavirus. Questo stesso test PCR viene utilizzato per rilevare il virus nei tamponi orofaringei. Amplificazione parallela del virus di controllo per il calcolo dell’efficienza di estrazione.

• Esito: presenza/assenza di SARS-CoV2 nei campioni, quantificazione relativa.

• Elaborazione dei dati entro 48h dall’arrivo dei campioni in laboratorio.

Nota1: L’RNA è il materiale genetico del SARS CoV-2, che contiene tutte le informazioni per la moltiplicazione del virus nelle cellule del suo ospite.

Nota 2: La real-time RT-PCR è una tecnica che consente di sintetizzare una molecola di DNA a doppio filamento  a partire da uno stampo a RNA (trascrizione inversa, RT). Successivamente il DNA è amplificato da reazioni a catena di un enzima chiamato DNA-polimerasi. Dopo ogni ciclo di amplificazione, la quantità DNA raddoppia, diventando “visibile” allo strumento e quantificabile in tempo reale durante la reazione. Il corredo genetico del SARS- CoV-2 è un filamento di RNA, per questo motivo è necessario il passaggio di retrotrascrizione.

• Nessun dato può essere interpretato da solo: tutti i dati relativi ad un singolo campionamento devono essere messi in relazione ai dati precedenti e a quelli successivi (dinamica della curva), perché per sua natura il campionamento potrebbe non essere rappresentativo.
• Non è possibile dalle analisi del refluo stabilire se il segnale debba essere attribuito ai nuovi infetti o a persone che hanno già passato la fase critica, ma che continuano ad emettere il virus.
• L’analisi dei reflui può confermare se le misure di contenimento della circolazione del virus sono efficaci, con l’abbassamento dell’intensità del segnale.
• L’analisi dei reflui può essere utile a monitorare la diffusione del virus, laddove il sistema di tracciamento dei positivi non riesca a stare al passo con il numero crescente dei contagi.
• La curva della concentrazione dell’RNA⁽¹⁾ di SARS-CoV-2 nei reflui anticipa la curva dei cittadini, che afferiscono al singolo depuratore, positivi al virus di un periodo variabile tra i 4 e i 14 giorni.

Nota 1: L’RNA è il materiale genetico del SARS CoV-2, che contiene tutte le informazioni per la moltiplicazione del virus nelle cellule del suo ospite.

Descrizione della heatmap:
La rappresentazione grafica dei risultati analitici è una heatmap in cui ad ogni casella colorata corrisponde un campione analizzato. I risultati sono stati classificati in base al confronto tra le concentrazioni di RNA di SARS-CoV-2 rilevato nei campioni, dove la massima concentrazione misurata corrisponde al colore rosso acceso, e le altre concentrazioni variano proporzionalmente rispetto al massimo (rappresentazione grafica: gradazioni di colore dal rosso al giallo al verde, fino all’azzurro, che corrisponde all’assenza di segnale rilevato nel campione).

• Download heatmap

Annotazione: I dati e le informazioni raccolte con il monitoraggio venivano poi regolarmente trasmesse all’Azienda sanitaria dell’Alto Adige per la gestione integrata dell’emergenza pandemica da COVID19.